Այս հոդվածը սովորեցնում է ձեզ, թե ինչպես ընտրել հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի սյունակ

Հեղուկ քրոմատոգրաֆիան հումքի, միջանկյալ նյութերի, պատրաստուկների և փաթեթավորման նյութերում յուրաքանչյուր բաղադրիչի և կեղտերի պարունակությունը ստուգելու հիմնական մեթոդն է, սակայն շատ նյութեր չունեն ստանդարտ մեթոդներ, որոնց վրա կարելի է հիմնվել, ուստի անխուսափելի է նոր մեթոդների մշակումը: Հեղուկ փուլային մեթոդների մշակման ժամանակ քրոմատոգրաֆիկ սյունակը հեղուկ քրոմատագրության առանցքն է, ուստի կարևոր է, թե ինչպես ընտրել համապատասխան քրոմատոգրաֆիկ սյունակ: Այս հոդվածում հեղինակը կբացատրի, թե ինչպես ընտրել հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի սյունակ երեք ասպեկտներից՝ ընդհանուր գաղափարներ, նկատառումներ և կիրառման շրջանակ:

A. Ընդհանուր գաղափարներ հեղուկ քրոմատագրման սյուների ընտրության համար

1. Գնահատեք անալիտի ֆիզիկական և քիմիական հատկությունները, ինչպիսիք են քիմիական կառուցվածքը, լուծելիությունը, կայունությունը (օրինակ՝ հեշտ է օքսիդացնել/նվազեցնել/հիդրոլիզել), թթվայնությունը և ալկալայնությունը և այլն, հատկապես քիմիական կառուցվածքը կարևոր է: հատկությունները որոշող գործոն, ինչպիսին է, օրինակ, խոնարհված խումբն ունի ուժեղ ուլտրամանուշակագույն կլանում և ուժեղ լյումինեսցենտություն.

2. Որոշեք վերլուծության նպատակը. արդյոք պահանջվում է բարձր տարանջատում, բարձր սյունակի արդյունավետություն, վերլուծության կարճ ժամանակ, բարձր զգայունություն, բարձր ճնշման դիմադրություն, երկար սյունակի կյանք, ցածր արժեք և այլն;

1. Ընտրեք համապատասխան քրոմատոգրաֆիկ սյունակ. հասկանալ քրոմատոգրաֆիկ լցանյութի կազմը, ֆիզիկական և քիմիական հատկությունները, ինչպիսիք են մասնիկների չափը, ծակոտիների չափը, ջերմաստիճանի հանդուրժողականությունը, pH-ի հանդուրժողականությունը, անալիտի կլանումը և այլն:

1. Հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի սյուների ընտրության նկատառումներ

Այս գլխում կքննարկվեն այն գործոնները, որոնք պետք է հաշվի առնել քրոմատոգրաֆիայի սյունակ ընտրելիս հենց քրոմատոգրաֆիայի սյունակի ֆիզիկական և քիմիական հատկությունների տեսանկյունից: 2.1 Լցնող մատրիցա

2.1.1 Սիլիկա գելային մատրիցա Հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի սյուների մեծ մասի լցավորիչ մատրիցը սիլիկատագելն է: Այս տեսակի լցոնիչն ունի բարձր մաքրություն, ցածր գին, բարձր մեխանիկական ուժ և հեշտ է փոփոխել խմբերը (ինչպիսիք են ֆենիլային կապը, ամինային կապը, ցիանային կապը և այլն), սակայն pH արժեքը և ջերմաստիճանի տիրույթը, որը հանդուրժում է, սահմանափակ են. Սիլիկա գելային մատրիցային լցոնիչների մեծ մասի pH միջակայքը 2-ից 8 է, սակայն հատուկ փոփոխված սիլիկա գելով կապակցված փուլերի pH-ի միջակայքը կարող է լինել 1,5-ից 10, և կան նաև հատուկ ձևափոխված սիլիկա գելով կապակցված փուլեր, որոնք կայուն են ցածր pH-ում: ինչպիսին է Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18-ը, որը կայուն է pH 1-ից 8-ում; Սիլիկա գելի մատրիցի վերին ջերմաստիճանի սահմանը սովորաբար 60 ℃ է, և որոշ քրոմատագրման սյունակներ կարող են հանդուրժել 40 ℃ ջերմաստիճանը բարձր pH-ում:

2.1.2 Պոլիմերային մատրիցա Պոլիմերային լցոնիչները հիմնականում պոլիստիրոլ-դիվինիլբենզոլ են կամ պոլիմետակրիլատ: Նրանց առավելություններն այն են, որ նրանք կարող են հանդուրժել pH-ի լայն շրջանակ. դրանք կարող են օգտագործվել 1-ից 14-ի սահմաններում, և նրանք ավելի դիմացկուն են բարձր ջերմաստիճանների նկատմամբ (կարող են հասնել 80 °C-ից բարձր): Սիլիցիումի վրա հիմնված C18 լցոնիչների համեմատ, այս տեսակի լցոնիչն ունի ավելի ուժեղ հիդրոֆոբություն, և մակրածակոտկ պոլիմերը շատ արդյունավետ է այնպիսի նմուշներ, ինչպիսիք են սպիտակուցները բաժանելը: Դրա թերություններն այն են, որ սյունակի արդյունավետությունն ավելի ցածր է, իսկ մեխանիկական ուժն ավելի թույլ է, քան սիլիցիումի վրա հիմնված լցոնիչները: 2.2 Մասնիկների ձև

Ժամանակակից HPLC լցոնիչների մեծ մասը գնդաձև մասնիկներ են, բայց երբեմն դրանք անկանոն մասնիկներ են: Գնդաձև մասնիկները կարող են ապահովել սյունակի ավելի ցածր ճնշում, սյունակի ավելի բարձր արդյունավետություն, կայունություն և ավելի երկար կյանք; երբ օգտագործվում են բարձր մածուցիկությամբ շարժական փուլեր (օրինակ՝ ֆոսֆորական թթու) կամ երբ նմուշի լուծույթը մածուցիկ է, անկանոն մասնիկները ունեն ավելի մեծ հատուկ մակերես, որն ավելի նպաստում է երկու փուլերի լիարժեք գործողությանը, իսկ գինը՝ համեմատաբար ցածր: 2.3 Մասնիկների չափը

Որքան փոքր է մասնիկների չափը, այնքան բարձր է սյունակի արդյունավետությունը և այնքան բարձր է տարանջատումը, բայց այնքան ավելի վատ է բարձր ճնշման դիմադրությունը: Առավել հաճախ օգտագործվող սյունակը 5 մկմ մասնիկի չափի սյունն է; եթե տարանջատման պահանջը մեծ է, կարող է ընտրվել 1,5-3 մկմ լցոնիչ, որը նպաստում է որոշ բարդ մատրիցային և բազմաբաղադրիչ նմուշների տարանջատման խնդրի լուծմանը: UPLC-ն կարող է օգտագործել 1,5 մկմ լցոնիչներ; 10 մկմ կամ ավելի մեծ մասնիկների չափի լցոնիչներ հաճախ օգտագործվում են կիսապատրաստական ​​կամ նախապատրաստական ​​սյուների համար: 2.4 Ածխածնի պարունակությունը

Ածխածնի պարունակությունը վերաբերում է սիլիկա գելի մակերևույթի վրա կապակցված փուլի համամասնությանը, որը կապված է հատուկ մակերեսի և խճճված փուլի ծածկույթի հետ: Ածխածնի բարձր պարունակությունը ապահովում է սյունակի բարձր հզորություն և բարձր լուծում, և հաճախ օգտագործվում է բարդ նմուշների համար, որոնք պահանջում են բարձր տարանջատում, սակայն երկու փուլերի միջև երկար փոխազդեցության ժամանակի պատճառով վերլուծության ժամանակը երկար է. Ցածր ածխածնի պարունակությամբ քրոմատոգրաֆիկ սյունակներն ունեն ավելի կարճ անալիզի ժամանակ և կարող են ցույց տալ տարբեր ընտրողականություն և հաճախ օգտագործվում են պարզ նմուշների համար, որոնք պահանջում են արագ վերլուծություն և նմուշների համար, որոնք պահանջում են բարձր ջրային փուլային պայմաններ: Ընդհանուր առմամբ, C18-ի ածխածնի պարունակությունը տատանվում է 7%-ից մինչև 19%: 2.5 Ծակոտիների չափը և հատուկ մակերեսը

HPLC-ի կլանման միջավայրը ծակոտկեն մասնիկներ են, և փոխազդեցությունների մեծ մասը տեղի է ունենում ծակոտիներում: Հետևաբար, մոլեկուլները պետք է մտնեն ծակոտիներ, որպեսզի դրանք կլանվեն և առանձնացվեն:

Ծակոտիների չափը և հատուկ մակերեսը երկու փոխլրացնող հասկացություններ են: Փոքր ծակոտի չափը նշանակում է մեծ հատուկ մակերես, և հակառակը: Մեծ հատուկ մակերեսը կարող է մեծացնել նմուշի մոլեկուլների և կապակցված փուլերի փոխազդեցությունը, բարձրացնել պահպանումը, մեծացնել նմուշի բեռնումը և սյունակի հզորությունը և բարդ բաղադրիչների տարանջատումը: Լիովին ծակոտկեն լցոնիչները պատկանում են այս տեսակի լցոնիչներին: Նրանց համար, ովքեր ունեն առանձնացման բարձր պահանջներ, խորհուրդ է տրվում ընտրել մեծ հատուկ մակերեսով լցոնիչներ. փոքր հատուկ մակերեսը կարող է նվազեցնել հետևի ճնշումը, բարելավել սյունակի արդյունավետությունը և նվազեցնել հավասարակշռության ժամանակը, որը հարմար է գրադիենտ վերլուծության համար: Core-shell fillers-ը պատկանում է այս տեսակի լցոնիչներին: Տարանջատումն ապահովելու համար խորհուրդ է տրվում ընտրել փոքր հատուկ մակերեսով լցոնիչներ՝ վերլուծության արդյունավետության բարձր պահանջներ ունեցողների համար: 2.6 Ծակոտիների ծավալը և մեխանիկական ուժը

Ծակոտիների ծավալը, որը նաև հայտնի է որպես «ծակոտի ծավալ», վերաբերում է միավորի մեկ մասնիկի դատարկ ծավալի չափին: Այն կարող է լավ արտացոլել լցոնիչի մեխանիկական ուժը: Մեծ ծակոտկեն ծավալով լցոնիչների մեխանիկական ուժը մի փոքր ավելի թույլ է, քան փոքր ծակոտկեն ծավալով լցոնիչներինը: 1,5 մլ/գ-ից փոքր ծակոտի ծավալով լցոնիչներ հիմնականում օգտագործվում են HPLC տարանջատման համար, մինչդեռ 1,5 մլ/գ-ից ավելի ծակոտիների ծավալով լցոնիչներ հիմնականում օգտագործվում են մոլեկուլային բացառման քրոմատագրման և ցածր ճնշման քրոմատագրման համար: 2.7 Սահմանափակման դրույքաչափը

Կափարիչը կարող է նվազեցնել միացությունների և բաց սիլանոլ խմբերի փոխազդեցության հետևանքով առաջացած պոչերի գագաթները (օրինակ՝ իոնային կապը ալկալային միացությունների և սիլանոլ խմբերի միջև, վան դեր Վալսի ուժերը և ջրածնային կապերը թթվային միացությունների և սիլանոլ խմբերի միջև), դրանով իսկ բարելավելով սյունակի արդյունավետությունը և գագաթի ձևը: . Չփակված խճճված փուլերը կառաջացնեն տարբեր ընտրողականություն՝ կապված կափարիչով կապակցված փուլերի հետ, հատկապես բևեռային նմուշների համար:

1. Տարբեր հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի սյունակների կիրառման շրջանակը

Այս գլուխը նկարագրելու է հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի տարբեր տեսակի սյունակների կիրառման շրջանակը որոշ դեպքերի միջոցով:

3.1 Հակադարձ փուլ C18 քրոմատոգրաֆիկ սյունակ

C18 սյունակը ամենից հաճախ օգտագործվող հակադարձ փուլային սյունն է, որը կարող է բավարարել օրգանական նյութերի մեծ մասի պարունակության և կեղտոտության թեստերը և կիրառելի է միջին բևեռային, թույլ բևեռային և ոչ բևեռային նյութերի համար: C18 քրոմատոգրաֆիկ սյունակի տեսակը և ճշգրտումը պետք է ընտրվեն առանձնացման հատուկ պահանջներին համապատասխան: Օրինակ, առանձնացման բարձր պահանջներ ունեցող նյութերի համար հաճախ օգտագործվում են 5 մկմ*4.6 մմ*250 մմ բնութագրեր. Բարդ տարանջատման մատրիցներով և նմանատիպ բևեռականություն ունեցող նյութերի համար կարող են օգտագործվել 4 մկմ*4,6 մմ*250 մմ բնութագրեր կամ ավելի փոքր մասնիկների չափսեր։ Օրինակ՝ հեղինակը օգտագործել է 3 մկմ*4,6 մմ*250 մմ սյունակ՝ celecoxib API-ում երկու գենոտոքսիկ խառնուրդներ հայտնաբերելու համար: Երկու նյութերի տարանջատումը կարող է հասնել 2,9-ի, ինչը գերազանց է։ Բացի այդ, տարանջատման ապահովման նախադրյալի ներքո, եթե արագ վերլուծություն է պահանջվում, հաճախ ընտրվում է 10 մմ կամ 15 մմ կարճ սյունակ: Օրինակ, երբ հեղինակն օգտագործել է LC-MS/MS՝ պիպերաքին ֆոսֆատ API-ում գենոտոքսիկ խառնուրդ հայտնաբերելու համար, օգտագործվել է 3 մկմ*2,1 մմ*100 մմ սյունակ: Աղտոտվածության և հիմնական բաղադրիչի միջև տարանջատումը 2.0 էր, իսկ նմուշի հայտնաբերումը կարող է ավարտվել 5 րոպեում: 3.2 Հակառակ փուլի ֆենիլ սյունակ

Ֆենիլային սյունը նույնպես հակադարձ փուլային սյունակի տեսակ է: Այս տեսակի սյունակները ուժեղ ընտրողականություն ունեն անուշաբույր միացությունների համար: Եթե ​​սովորական C18 սյունակով չափվող անուշաբույր միացությունների արձագանքը թույլ է, կարող եք մտածել ֆենիլային սյունակի փոխարինման մասին: Օրինակ, երբ ես պատրաստում էի celecoxib API-ն, հիմնական բաղադրիչի արձագանքը, որը չափվում էր նույն արտադրողի ֆենիլային սյունակով և նույն ճշգրտմամբ (բոլորը 5 մկմ*4,6 մմ*250 մմ) մոտ 7 անգամ գերազանցում էր C18 սյունակին: 3.3 Նորմալ փուլային սյունակ

Որպես հակադարձ փուլային սյունակի արդյունավետ հավելում, նորմալ փուլային սյունը հարմար է բարձր բևեռային միացությունների համար: Եթե ​​հակադարձ փուլային սյունակում 90%-ից ավելի ջրային ֆազով ողողելիս գագաթնակետը դեռ շատ արագ է, և նույնիսկ մոտ է լուծիչի գագաթնակետին և համընկնում է դրա հետ, կարող եք մտածել նորմալ փուլային սյունակի փոխարինման մասին: Այս տեսակի սյունակները ներառում են բլիթային սյունակ, ամինո սյուն, ցիանո սյուն և այլն:

3.3.1 Հիլիկ սյուն Հիլիկ սյունակում սովորաբար հիդրոֆիլ խմբեր է տեղադրվում կապակցված ալկիլային շղթայում՝ բևեռային նյութերի նկատմամբ արձագանքը ուժեղացնելու համար: Այս տեսակի սյունակը հարմար է շաքարային նյութերի վերլուծության համար: Հեղինակը օգտագործել է այս տեսակի սյունակ՝ քսիլոզայի և դրա ածանցյալների բովանդակությունը և հարակից նյութերը կատարելիս: Քսիլոզայի ածանցյալի իզոմերները նույնպես կարող են լավ տարանջատվել.

3.3.2 Ամինո սյունը և ցիանո սյունը Ամինո սյունը և ցիանո սյունը վերաբերում են համապատասխանաբար կապված ալկիլային շղթայի վերջում ամինո և ցիանո մոդիֆիկացիաների ներդրմանը հատուկ նյութերի ընտրողականությունը բարելավելու համար. օրինակ, ամինո սյունը լավ ընտրություն է: շաքարների, ամինաթթուների, հիմքերի և ամիդների տարանջատման համար. ցիանո սյունը ավելի լավ ընտրողականություն ունի հիդրոգենացված և չհիդրոգենացված կառուցվածքային նմանատիպ նյութերը բաժանելիս՝ կապված կոնյուգացված կապերի առկայության հետ: Ամինո սյունը և ցիանո սյունը հաճախ կարող են փոխարկվել սովորական փուլային սյունակի և հակադարձ փուլային սյունակի միջև, սակայն հաճախակի փոխարկումը խորհուրդ չի տրվում: 3.4 Chiral սյունակ

Chiral սյունը, ինչպես ենթադրում է անունը, հարմար է քիրալային միացությունների տարանջատման և վերլուծության համար, հատկապես դեղագործության ոլորտում: Այս տեսակի սյունակները կարելի է դիտարկել, երբ սովորական հակադարձ փուլային և նորմալ ֆազային սյունակները չեն կարող հասնել իզոմերների տարանջատմանը: Օրինակ՝ հեղինակն օգտագործել է 5 մկմ*4,6 մմ*250 մմ քիրալային սյունակ՝ առանձնացնելու 1,2-դիֆենիլէթիլենդիամինի երկու իզոմերները՝ (1S, 2S)-1, 2-դիֆենիլէթիլենդիամին և (1R, 2R)-1, 2: -դիֆենիլէթիլենդիամին, և երկուսի միջև տարանջատումը հասել է մոտ 2.0-ի: Այնուամենայնիվ, քիրալային սյուները ավելի թանկ են, քան սյուների այլ տեսակներ, սովորաբար 1W+/հատ: Եթե ​​նման սյուների կարիք կա, ապա միավորը պետք է բավարար բյուջե կազմի: 3.5 Իոնափոխանակման սյունակ

Իոնափոխանակման սյունակները հարմար են լիցքավորված իոնների, օրինակ՝ իոնների, սպիտակուցների, նուկլեինաթթուների և որոշ շաքարային նյութերի բաժանման և վերլուծության համար։ Ըստ լցանյութի տեսակի՝ դրանք բաժանվում են կատիոնափոխանակման սյուների, անիոնափոխանակման սյուների և ուժեղ կատիոնափոխանակման սյուների։

Կատիոնների փոխանակման սյուները ներառում են կալցիումի և ջրածնի վրա հիմնված սյունակներ, որոնք հիմնականում հարմար են կատիոնային նյութերի վերլուծության համար, ինչպիսիք են ամինաթթուները: Օրինակ, հեղինակը օգտագործել է կալցիումի վրա հիմնված սյունակներ, երբ վերլուծել է կալցիումի գլյուկոնատը և կալցիումի ացետատը լվացող լուծույթում: Երկու նյութերն էլ ուժեղ արձագանքներ են ունեցել λ=210նմ, իսկ տարանջատման աստիճանը հասել է 3.0; գլյուկոզայի հետ կապված նյութերը վերլուծելիս հեղինակը օգտագործել է ջրածնի վրա հիմնված սյունակներ: Մի քանի հիմնական հարակից նյութեր՝ մալտոզա, մալտոտրիոզա և ֆրուկտոզա, ունեին բարձր զգայունություն դիֆերենցիալ դետեկտորների տակ, հայտնաբերման սահմանաչափով մինչև 0,5 ppm և տարանջատման աստիճանը 2,0-2,5:

Անիոնափոխանակման սյուները հիմնականում հարմար են անիոնային նյութերի վերլուծության համար, ինչպիսիք են օրգանական թթուները և հալոգեն իոնները. ուժեղ կատիոնափոխանակման սյուներն ունեն իոնափոխանակման ավելի բարձր հզորություն և ընտրողականություն և հարմար են բարդ նմուշների տարանջատման և վերլուծության համար:

Վերոնշյալը պարզապես ներածություն է մի քանի սովորական հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի սյունակների տեսակների և կիրառման տիրույթների մասին՝ համակցված հեղինակի սեփական փորձի հետ: Իրական կիրառություններում կան նաև այլ հատուկ տեսակի քրոմատոգրաֆիկ սյուներ, ինչպիսիք են մեծ ծակոտկեն քրոմատոգրաֆիկ սյունակները, փոքր ծակոտկեն քրոմատոգրաֆիայի սյունակները, հարաբերական քրոմատոգրաֆիայի սյունակները, մուլտիմոդի քրոմատոգրաֆիկ սյունակները, գերբարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի սյունակները (UHPLC), գերկրիտիկական հեղուկի սյունակները (քրոմատոգրաֆիա): SFC) և այլն: Նրանք կարևոր դեր են խաղում տարբեր ոլորտներում: Քրոմատոգրաֆիկ սյունակի հատուկ տեսակը պետք է ընտրվի նմուշի կառուցվածքի և հատկությունների, տարանջատման պահանջների և այլ նպատակների համաձայն: