Մանրէաբանական մետապրոտեոմիկա. նմուշների մշակումից, տվյալների հավաքագրումից մինչև տվյալների վերլուծություն

Ու Էնհույ, Քյաո Լյան*

Քիմիայի բաժին, Ֆուդանի համալսարան, Շանհայ 200433, Չինաստան

Միկրոօրգանիզմները սերտորեն կապված են մարդու հիվանդությունների և առողջության հետ: Ինչպես հասկանալ մանրէաբանական համայնքների կազմը և նրանց գործառույթները, կարևոր խնդիր է, որը հրատապ ուսումնասիրության կարիք ունի: Վերջին տարիներին մետապրոտեոմիկան դարձել է միկրոօրգանիզմների բաղադրությունն ու ֆունկցիան ուսումնասիրելու կարևոր տեխնիկական միջոց։ Այնուամենայնիվ, մանրէաբանական համայնքի նմուշների բարդության և բարձր տարասեռության պատճառով նմուշների մշակումը, զանգվածային սպեկտրոմետրիայի տվյալների հավաքագրումը և տվյալների վերլուծությունը դարձել են մետապրոտեոմիկայի երեք հիմնական մարտահրավերները: Metaproteomics վերլուծության ժամանակ հաճախ անհրաժեշտ է օպտիմալացնել տարբեր տեսակի նմուշների նախնական մշակումը և ընդունել մանրէների տարանջատման, հարստացման, արդյունահանման և լիզիման տարբեր սխեմաներ: Մեկ տեսակի պրոտեոմի նման, մետապրոտեոմիկայի զանգվածային սպեկտրոմետրիայի տվյալների ձեռքբերման եղանակները ներառում են տվյալներից կախված ձեռքբերման (DDA) ռեժիմները և տվյալներից անկախ ձեռքբերման (DIA) ռեժիմները: DIA տվյալների հավաքագրման ռեժիմը կարող է ամբողջությամբ հավաքել նմուշի պեպտիդային տեղեկատվությունը և ունի զարգացման մեծ ներուժ: Այնուամենայնիվ, մետապրոտեոմի նմուշների բարդության պատճառով նրա DIA տվյալների վերլուծությունը դարձել է հիմնական խնդիր, որը խոչընդոտում է մետապրոտեոմիկայի խորը լուսաբանմանը: Տվյալների վերլուծության առումով ամենակարեւոր քայլը սպիտակուցային հաջորդականության տվյալների բազայի կառուցումն է: Տվյալների բազայի չափը և ամբողջականությունը ոչ միայն մեծ ազդեցություն ունեն նույնականացումների քանակի վրա, այլև ազդում են տեսակների և ֆունկցիոնալ մակարդակներում վերլուծության վրա: Ներկայումս մետապրոտեոմային տվյալների բազայի կառուցման ոսկե ստանդարտը սպիտակուցային հաջորդականության տվյալների բազան է, որը հիմնված է մետագենոմի վրա: Միևնույն ժամանակ, հրապարակային տվյալների բազայի զտման մեթոդը, որը հիմնված է կրկնվող որոնման վրա, նույնպես ապացուցված է, որ ունի ուժեղ գործնական արժեք: Տվյալների վերլուծության հատուկ ռազմավարությունների տեսանկյունից, պեպտիդակենտրոն DIA տվյալների վերլուծության մեթոդները զբաղեցրել են բացարձակ հիմնական հոսք: Խորը ուսուցման և արհեստական ​​ինտելեկտի զարգացման շնորհիվ այն մեծապես կնպաստի մակրոպրոտեոմային տվյալների վերլուծության ճշգրտությանը, ծածկույթին և վերլուծության արագությանը: Կենսաինֆորմատիկական վերլուծության առումով վերջին տարիներին մշակվել են անոտացիոն գործիքների մի շարք, որոնք կարող են տեսակների անոտացիա կատարել սպիտակուցի, պեպտիդների և գեների մակարդակով՝ մանրէաբանական համայնքների կազմը ստանալու համար: Համեմատած այլ omics մեթոդների հետ, մանրէաբանական համայնքների ֆունկցիոնալ վերլուծությունը մակրոպրոտեոմիկայի եզակի առանձնահատկությունն է: Մակրոպրոտեոմիկան դարձել է մանրէաբանական համայնքների բազմաօմիկական վերլուծության կարևոր մասը և դեռևս զարգացման մեծ ներուժ ունի ծածկույթի խորության, հայտնաբերման զգայունության և տվյալների վերլուծության ամբողջականության առումով:

01Նմուշի նախնական մշակում

Ներկայումս մետապրոտեոմիկայի տեխնոլոգիան լայնորեն կիրառվում է մարդու միկրոբիոմի, հողի, սննդի, օվկիանոսի, ակտիվ տիղմի և այլ ոլորտների հետազոտության մեջ։ Համեմատած մեկ տեսակի պրոտեոմի վերլուծության հետ, բարդ նմուշների մետապրոտեոմի նմուշի նախնական մշակումն ավելի շատ դժվարությունների է բախվում: Իրական նմուշներում մանրէաբանական կազմը բարդ է, առատության դինամիկ միջակայքը մեծ է, տարբեր տեսակի միկրոօրգանիզմների բջջային պատի կառուցվածքը շատ տարբեր է, և նմուշները հաճախ պարունակում են մեծ քանակությամբ հյուրընկալող սպիտակուցներ և այլ կեղտեր: Հետևաբար, մետապրոտեոմի վերլուծության ժամանակ հաճախ անհրաժեշտ է լինում օպտիմալացնել տարբեր տեսակի նմուշներ և ընդունել մանրէների տարանջատման, հարստացման, արդյունահանման և լիզի տարբեր սխեմաներ:

Տարբեր նմուշներից մանրէաբանական մետապրոտեոմների արդյունահանումը ունի որոշակի նմանություններ, ինչպես նաև որոշ տարբերություններ, սակայն ներկայումս բացակայում է մետապրոտեոմի տարբեր տեսակի նմուշների նախնական մշակման միասնական գործընթաց:

02Զանգվածային սպեկտրոմետրիայի տվյալների հավաքում

Որսորդական հրացանի պրոտեոմի վերլուծության ժամանակ պեպտիդային խառնուրդը նախնական մշակումից հետո նախ առանձնացվում է քրոմատոգրաֆիկ սյունակում, այնուհետև մտնում է զանգվածային սպեկտրոմետր՝ իոնացումից հետո տվյալների ձեռքբերման համար: Ինչպես մեկ տեսակի պրոտեոմի վերլուծությանը, զանգվածային սպեկտրոմետրիայի տվյալների ստացման եղանակները մակրոպրոտեոմային վերլուծության մեջ ներառում են DDA ռեժիմը և DIA ռեժիմը:

Զանգվածային սպեկտրոմետրիայի գործիքների շարունակական կրկնությամբ և թարմացմամբ, մետապրոտեոմի նկատմամբ կիրառվում են ավելի բարձր զգայունությամբ և լուծույթով զանգվածային սպեկտրոմետրի գործիքներ, և մետապրոտեոմի վերլուծության ծածկույթի խորությունը նույնպես շարունակաբար բարելավվում է: Երկար ժամանակ մետապրոտեոմում լայնորեն կիրառվում են զանգվածային սպեկտրոմետրիայի մի շարք գործիքներ՝ Orbitrap-ի ղեկավարությամբ։

Բնօրինակ տեքստի 1-ին աղյուսակը ցույց է տալիս որոշ ներկայացուցչական ուսումնասիրություններ մետապրոտեոմիկայի վերաբերյալ 2011-ից մինչ օրս՝ նմուշի տեսակի, վերլուծության ռազմավարության, զանգվածային սպեկտրոմետրիայի գործիքի, ձեռքբերման մեթոդի, վերլուծության ծրագրաշարի և նույնականացումների քանակի առումով:

03Զանգվածային սպեկտրոմետրիայի տվյալների վերլուծություն

3.1 DDA տվյալների վերլուծության ռազմավարություն

3.1.1 Տվյալների բազայի որոնում

3.1.2de novoհաջորդականության ռազմավարություն

3.2 DIA տվյալների վերլուծության ռազմավարություն

04 Տեսակների դասակարգում և ֆունկցիոնալ անոտացիա

Տարբեր տաքսոնոմիական մակարդակներում մանրէաբանական համայնքների կազմը միկրոբիոմի հետազոտության հիմնական հետազոտական ​​ուղղություններից մեկն է: Վերջին տարիներին մշակվել են ծանոթագրման մի շարք գործիքներ՝ տեսակները սպիտակուցի, պեպտիդների և գեների մակարդակով ծանոթագրելու համար՝ մանրէաբանական համայնքների կազմը ստանալու համար:

Ֆունկցիոնալ անոտացիայի էությունը թիրախային սպիտակուցի հաջորդականության համեմատությունն է ֆունկցիոնալ սպիտակուցային հաջորդականության տվյալների բազայի հետ: Օգտագործելով գենային ֆունկցիաների տվյալների բազաները, ինչպիսիք են GO, COG, KEGG, eggNOG և այլն, տարբեր ֆունկցիոնալ անոտացիոն վերլուծություններ կարող են իրականացվել մակրոպրոտեոմների կողմից հայտնաբերված սպիտակուցների վրա: Անոտացիայի գործիքները ներառում են Blast2GO, DAVID, KOBAS և այլն:

05 Ամփոփում և հեռանկար

Միկրոօրգանիզմները կարևոր դեր են խաղում մարդու առողջության և հիվանդությունների համար: Վերջին տարիներին մետապրոտեոմիկան դարձել է մանրէաբանական համայնքների գործառույթների ուսումնասիրման կարևոր տեխնիկական միջոց: Metaproteomics-ի վերլուծական գործընթացը նման է մեկ տեսակի պրոտեոմիկայի գործընթացին, սակայն մետապրոտեոմիկայի հետազոտական ​​օբյեկտի բարդության պատճառով յուրաքանչյուր վերլուծության փուլում պետք է որդեգրվեն հատուկ հետազոտական ​​ռազմավարություններ՝ սկսած նմուշի նախնական մշակումից, տվյալների հավաքագրումից մինչև տվյալների վերլուծություն: Ներկայումս, նախնական մշակման մեթոդների կատարելագործման, զանգվածային սպեկտրոմետրիայի տեխնոլոգիայի շարունակական նորարարության և կենսաինֆորմատիկայի արագ զարգացման շնորհիվ, մետապրոտեոմիկան մեծ առաջընթաց է գրանցել նույնականացման խորության և կիրառման շրջանակում:

Մակրոպրոտեոմի նմուշների նախնական մշակման գործընթացում նախ պետք է հաշվի առնել նմուշի բնույթը: Ինչպես առանձնացնել միկրոօրգանիզմները շրջակա միջավայրի բջիջներից և սպիտակուցներից, մակրոպրոտեոմների առջև ծառացած հիմնական մարտահրավերներից մեկն է, և տարանջատման արդյունավետության և մանրէների կորստի միջև հավասարակշռությունը հրատապ խնդիր է, որը պետք է լուծվի: Երկրորդ, միկրոօրգանիզմների սպիտակուցի արդյունահանումը պետք է հաշվի առնի տարբեր բակտերիաների կառուցվածքային տարասեռության պատճառով առաջացած տարբերությունները: Մակրոպրոտեոմի նմուշները հետքի տիրույթում նույնպես պահանջում են նախնական մշակման հատուկ մեթոդներ:

Զանգվածային սպեկտրոմետրիայի գործիքների առումով, զանգվածային սպեկտրոմետրի հիմնական սարքերը անցել են զանգվածային սպեկտրոմետրերից, որոնք հիմնված են Orbitrap զանգվածային անալիզատորների վրա, ինչպիսիք են LTQ-Orbitrap-ը և Q Exactive-ը, զանգվածային սպեկտրոմետրերի, որոնք հիմնված են իոնային շարժունակության զուգակցված թռիչքի ժամանակի զանգվածային անալիզատորների վրա, ինչպիսիք են timsTOF Pro-ն: . Իոնների շարժունակության չափման տեղեկատվություն ունեցող timsTOF գործիքների շարքը ունեն բարձր հայտնաբերման ճշգրտություն, հայտնաբերման ցածր սահման և լավ կրկնելիություն: Դրանք աստիճանաբար կարևոր գործիքներ են դարձել հետազոտական ​​տարբեր ոլորտներում, որոնք պահանջում են զանգվածային սպեկտրոմետրիայի հայտնաբերում, ինչպիսիք են մեկ տեսակի պրոտեոմը, մետապրոտեոմը և մետաբոլոմը: Հարկ է նշել, որ երկար ժամանակ զանգվածային սպեկտրոմետրիայի գործիքների դինամիկ տիրույթը սահմանափակել է մետապրոտեոմի հետազոտության սպիտակուցային ծածկույթի խորությունը: Ապագայում զանգվածային սպեկտրոմետրիայի գործիքներն ավելի մեծ դինամիկ տիրույթով կարող են բարելավել մետապրոտեոմներում սպիտակուցի նույնականացման զգայունությունն ու ճշգրտությունը:

Զանգվածային սպեկտրոմետրիայի տվյալների հավաքագրման համար, թեև DIA տվյալների հավաքագրման ռեժիմը լայնորեն ընդունվել է մեկ տեսակի պրոտեոմում, ներկայիս մակրոպրոտեոմային վերլուծությունների մեծ մասը դեռ օգտագործում է DDA տվյալների հավաքագրման ռեժիմը: DIA տվյալների հավաքագրման ռեժիմը կարող է ամբողջությամբ ստանալ նմուշի բեկորային իոնային տեղեկատվությունը, և DDA տվյալների ստացման ռեժիմի հետ համեմատած, այն ունի մակրոպրոտեոմի նմուշի պեպտիդային տեղեկատվությունը ամբողջությամբ ստանալու ներուժ: Այնուամենայնիվ, DIA-ի տվյալների բարձր բարդության պատճառով DIA-ի մակրոպրոտեոմի տվյալների վերլուծությունը դեռևս մեծ դժվարությունների է հանդիպում: Ակնկալվում է, որ արհեստական ​​ինտելեկտի և խորը ուսուցման զարգացումը կբարելավի DIA տվյալների վերլուծության ճշգրտությունն ու ամբողջականությունը:

Metaproteomics-ի տվյալների վերլուծության մեջ առանցքային քայլերից մեկը սպիտակուցային հաջորդականության տվյալների բազայի կառուցումն է: Հանրաճանաչ հետազոտական ​​ոլորտների համար, ինչպիսիք են աղիքային ֆլորան, կարող են օգտագործվել աղիքային մանրէների տվյալների բազաները, ինչպիսիք են IGC-ն և HMP-ն, և ձեռք են բերվել նույնականացման լավ արդյունքներ: Այլ մետապրոտեոմիկայի վերլուծությունների մեծ մասի համար տվյալների բազայի կառուցման ամենաարդյունավետ ռազմավարությունը դեռևս մնում է նմուշի հատուկ սպիտակուցային հաջորդականության տվյալների բազայի ստեղծումը՝ հիմնված մետագենոմիկ հաջորդականության տվյալների վրա: Բարձր բարդությամբ և մեծ դինամիկ տիրույթով մանրէաբանական համայնքի նմուշների համար անհրաժեշտ է ավելացնել հաջորդականության խորությունը՝ ցածր առատությամբ տեսակների նույնականացումը մեծացնելու համար՝ դրանով իսկ բարելավելով սպիտակուցային հաջորդականության տվյալների բազայի ծածկույթը: Երբ տվյալների հաջորդականությունը բացակայում է, կրկնվող որոնման մեթոդը կարող է օգտագործվել հանրային տվյալների բազան օպտիմալացնելու համար: Այնուամենայնիվ, կրկնվող որոնումը կարող է ազդել FDR որակի վերահսկման վրա, ուստի որոնման արդյունքները պետք է ուշադիր ստուգվեն: Բացի այդ, FDR որակի վերահսկման ավանդական մոդելների կիրառելիությունը մետապրոտեոմիկայի վերլուծության մեջ դեռևս արժե ուսումնասիրել: Ինչ վերաբերում է որոնման ռազմավարությանը, հիբրիդային սպեկտրային գրադարանի ռազմավարությունը կարող է բարելավել DIA metaproteomics-ի ծածկույթի խորությունը: Վերջին տարիներին կանխատեսված սպեկտրային գրադարանը, որը ստեղծվել է խորը ուսուցման հիման վրա, ցույց է տվել բարձր արդյունավետություն DIA պրոտեոմիկայի մեջ: Այնուամենայնիվ, metaproteome տվյալների բազաները հաճախ պարունակում են միլիոնավոր սպիտակուցային գրառումներ, ինչը հանգեցնում է կանխատեսված սպեկտրային գրադարանների մեծ մասշտաբի, սպառում է շատ հաշվողական ռեսուրսներ և հանգեցնում է մեծ որոնման տարածության: Բացի այդ, մետապրոտեոմներում սպիտակուցային հաջորդականությունների միջև նմանությունը մեծապես տարբերվում է, ինչը դժվարացնում է սպեկտրային գրադարանի կանխատեսման մոդելի ճշգրտության ապահովումը, ուստի կանխատեսված սպեկտրային գրադարանները լայնորեն չեն օգտագործվել մետապրոտեոմիկայի մեջ: Բացի այդ, անհրաժեշտ է մշակել սպիտակուցների եզրակացության և դասակարգման ծանոթագրման նոր ռազմավարություններ՝ խիստ հաջորդականությամբ նման սպիտակուցների մետապրոտեոմիկայի վերլուծության համար կիրառելու համար:

Ամփոփելով, որպես միկրոբիոմի հետազոտության զարգացող տեխնոլոգիա, մետապրոտեոմիկայի տեխնոլոգիան հասել է զգալի հետազոտական ​​արդյունքների և ունի նաև զարգացման հսկայական ներուժ: